在进行磷酸化蛋白Western Blot（WB）实验时，很多研究者都遇到条带弱、背景高、结果飘忽不定的困扰。磷酸化蛋白WB被称为实验室中的“噩梦”，其主要原因是样品低丰度、高动态范围以及易降解等特点，任何步骤的细微差异都可能导致信号丢失或非特异性信号放大。今天，Dr. Connie将分析磷酸化蛋白WB实验中的痛点，并分享一些改善建议。

磷酸化蛋白WB痛点及解决方案

样本制备

1. **占比小**：磷酸化蛋白通常仅占总蛋白量的1%-10%，检测的信号接近WB的检测下限。
2. **动态范围窄**：激酶和磷酸酶的活性变化会导致磷酸化水平在几分钟内波动，例如EGF刺激后EGFR磷酸化5分钟达到峰值，30分钟后降至基线，易错过真实信号。
3. **磷酸酶的持续作用**：细胞裂解后会释放大量内源性蛋白磷酸酶，短时间内催化磷酸化蛋白的去磷酸化，导致磷酸化水平衰减。
4. **温度敏感**：在室温下，磷酸化蛋白的半衰期仅为数分钟，例如MAPK磷酸化在25℃下10分钟降解90%。
因此，确保蛋白样品的质量是成功的关键。建议在整个蛋白提取过程中使用冰浴，加入比例适当的磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，尽量使用新鲜样本，采用液氮速冻并在-80℃保存。

抗体选择

1. 查阅相关文献，确定目的蛋白的磷酸化位点，选择已经验证的磷酸化抗体，以提高信号灵敏度。
2. 总蛋白表达量可以作为内参，区分磷酸化蛋白与总蛋白的动态关系。因此，建议在实验中同时检测总蛋白表达水平，以确保磷酸化水平的相对变化能够被准确捕捉。

通过选择合适的抗体，如尊龙凯时人生就博旗下的各类磷酸化抗体，能够有效提高实验的成功率。

电泳及转膜

1. 根据目标蛋白的大小选择合适的胶浓度，电泳全程保持低温，避免因温度过高导致磷酸化降解。
2. 使用新鲜配置的转膜液，提高转膜效率，且PVDF膜比NC膜更有效捕捉磷酸化蛋白，适合磷酸化蛋白的转移。
3. 根据经验调整转膜时间或电压，避免小分子磷酸化蛋白的过度转膜。

封闭及抗体孵育

1. 封闭液建议使用5%BSA，避免背景过高。室温下封闭1小时即可。
2. 抗体孵育应按照厂商Protocol进行，建议一抗在4℃过夜以提高信号质量。

每个实验环节都可能影响最终结果，因此需特别关注样品的磷酸化状态并不断优化实验条件，以确保结果的准确性和可重复性。尊龙凯时人生就博致力于提供一系列高特异性、高灵敏度的磷酸化抗体，满足WB、IHC等多种应用需求。